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指的是什么安全？
首先，基因工程菌株的选择应对人体足够安全。一般选用哺乳动物体内共有的大肠杆菌，验证对人体无害的枯草芽孢杆菌和重要的生产真菌酵母，这些都是背景清晰对人体无害的微生物。禁止选择有毒有害的细菌或病毒作为工程菌，防止对实验人员的一切潜在威胁。
基因工程菌株的另一大安全性威胁在于基因的扩散问题。细菌中存在大量的基因交流，因此工程菌一旦不经治理排放到外界，会将工程基因散布到其他生物，造成不可预知的变异和基因污染。因此，基因工程菌的排放和处理需严格把关。同时，也应当设计更严格的防止基因转移的机制，如转移-死亡机制，将获得外源基因的非工程菌杀死，防止基因泄露污染。
举出至少4中PCR技术的原理及应用~
我是浙江2010年的，下面的是高考结束有人找我写的，希望对你有帮助。
拿到试卷，先统揽试卷，看看各题分值，这里尤其要注意的是不要被新颖的题型吓到，比如2010年浙江理综物理倒数第二题，看起来题目很长，好像要考能量、电学和光学，但其实它的问题很基本，都是我们很熟悉的。熟悉试卷后，考虑一下自己做题的顺序，如先做物理，再做化学，最后做生物。但以我个人经验看，生物选择题最先做，准确率会大大提高。一般来说，全卷选择题所花的时间不应超过40分钟，不能太快，尤其是多选题，选择题6分一题，实在错不起。对于看起来很熟悉的选择题，特别要小心一些细节和陷阱，千万不要想当然。选择题还要注意关键字词，如恰好，全部，可能，最多等，它们往往在一定程度上指明了解题方向和该题是否有多个解。
生物选择题如果有一道难以确定，千万不要死缠，比如像稳态方面的题，死缠也没用，还是先放一下好。化学选择题要做的稍快点，因为一般来说它们比较简单，要为后面的有机大题留出更多的时间。比如2010年浙江理综第10题，可以很快确定答案是A，其它选择支就可以跳过了，当然这样做的前提是你百分之百确定你选的那个答案正确。物理选择题最有效的便是作图，借助图像可以很快确定答案，既快又准确。物理多选题很少有ABCD都选的，因此当认为ABCD都正确时，还是要想一想，三思而后行。物理多选题还要注意一步到位，要保证每个选项都已经考虑过了，不要先选一个，再寄希望于最后的复查，一是因为理综复查的可能性基本为零，二是即使有时间，准确率也会大大下降。
物理实验题现在是21分，分值很大，一般是一道力学，一道电学。我刚开始也和很多同学一样，对于电学电路设计题很头疼，它往往给出多个电表，多个电阻，让你自己选择。对于这样的题目，我建议回归最基本的原理，因为这些题目都是课本实验的衍生品，只要牢牢把握电学实验的原理，基本模型，就不会出错。平时多做一些实验题，建议每天一题，并总结规律，比如测电表内阻的几种通用方法，测小灯泡电阻的方法等。
物理大题三题，一般是动力学，能量守恒和粒子运动，先易后难。一般第一题建议花5到8分钟，第二题10分钟左右，最后一题15分钟左右。做物理大题和选择题不同，一般不建议用非常规方法，还要注意所用的方法不应超出考纲范围，如运动方面的题目有时可以用动量的知识解决，但它不是考纲要求掌握的知识，参考答案也不会采纳，因此还是采用牛顿运动定律等来的保险。物理实验守恒题要注意题设条件，如光滑，不计一切摩擦等。各种能量在脑海里过一遍，做到万无一失。粒子运动题，把该拿的分全拿后立即抽身，不要再一个问题上死缠，我就有过这样的教训，物理最后一题花了很多时间，虽然分数全部拿到，但后面的生物大题就没时间了，很不值。物理解答题建议分布列式，这样不容易失分。不要采用综合式，因为综合式是一个式子错就全扣，很不保险。
化学大题四题，分别是无机推断，化学平衡，实验题和有机推断题。无机推断题主要考平时的积累，关键在于联想和找到突破口，如颜色，气味，特殊性质等往往为解题提供了方向，抓住这些信息，题目就能迎刃而解。如果一时没有头绪，可以先猜想，在草稿纸上写写看，看是否符合题意，当然，要保正速度。化学平衡题多有计算，要特别细心，如计算反应速率就要注意体积和时间，写热化学方程式还要注意温度和压强。实验题也是考平时的积累，它最能反映学生化学素养，因此出题老师往往喜欢考一些实验基础知识，这就需要我们平时多做多练，一般可采用一天一道无机实验题，同时熟悉各种仪器的使用规则和注意事项。有机推断题一般比较简单，抓住官能团是关键，写同分异构体时要全面完整，充分考虑各种情况，如有时要考虑醚这种结构。也要注意平时的总结，如丁基有四种就可以直接应用，既快又准确。
生物大题两题，三小题，分别是植物生理，动物生理和遗传题。生理实验题遵循经典步骤，即实验分组，设计对照，消除无关变量和因变量检测。这边只要规规矩矩的做，大部分分数就可拿到手。至于遗传题，靠的是细心加耐心，可以在草稿纸上写出各种基因型和遗传图解，这有助于解题和理顺思路。这里需要注意的是，若是题目要求写遗传图解，要看清是自交还是杂交，这两者可是完全不一样的，我曾经就上过当。在图解的最后，别忘了附上几句解说，做到万无一失。
以上是我个人对于理综的一些想法，仅供参考。最后再说一句，熟悉课本非常重要。
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5''端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的DNA为模板，引物是从3''端开始延伸， 其5''端是固定的，3'' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时， 由于新链模板的5''端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3''端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3''端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3''端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR反应特点
特异性强：
PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高：
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速：
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低：
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
PCR扩增产物的分析
PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶， 供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。
核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
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